Zwischen 1950 und 1955 führte der Biologe Ing. Karel Hartl in der ehemaligen CSSR biologische Experimente durch, bei denen es v.a. um wissenschaftliche Erkenntnisse ging. Diese Experimente stießen bei Armee und Grenzpolizei auf großes Interesse – man war daran interessiert, die Arbeitsleistung des DSH mit den Vorzügen des Wolfes (Ausdauer, Widerstandsfähigkeit, hohe Wachsamkeit, natürlich entwickelte Sinne) zu verbessern.
Durch 3 Verpaarungen Wolf – DSH (Karpatenwölfin Brita mit DSH-Rüden Cezar z Brezoveho – im Mai 1958 wurden die ersten Welpen geboren; Brita mit DSH Kurt z Vaclavky und 1968 Wolf Argo mit DSH-Hündin Asta z SNB) entstanden 3 Linien an Kreuzlingen. Aufgrund weiterer Verpaarungen der Kreuzlinge mit Deutschen Schäferhunden konnten folgende Erkenntnisse gezogen werden:
Bei Welpen der 1. Kreuzungsversuche (F1-Generation) setzten sich noch die Eigenschaften des Wolfes (Scheuheit, Fluchttendenz, Aggressivität bei Überschreiten der kritischen Distanz) stark durch, während bei den nächsten Generationen schon Eigenschaften der domestizierten Tiere zu erkennen waren, welche sich weiter verwenden ließen.
Kreuzungen der 3. und 4. Generation ließen sich bereits als Diensthunde beim Militär einsetzen. Haarfarbe und biometrische Masse hatten die Mischlinge vom Wolf geerbt, ebenso die Regenerationsfähigkeit nach erfolgter Belastung.
Nasenleistung und Orientierungssinn waren denen des DSH deutlich überlegen, außerdem erwiesen sie sich gegenüber Hitze, Kälte und Nässe resistenter. Dennoch waren zu einer Schutzausbildung nur wenige Hunde der F3 Generation zu gebrauchen, da die meisten schnell aggressiv wurden und es schwierig war, mit ihnen Unterordnungsübungen zu absolvieren. Sie arbeiteten zwar eine Fährte gut aus, weigerten sich danach aber, ein weiteres Mal eingesetzt zu werden. Die Hybriden schlossen sich sehr stark dem Menschen an, der sie fütterte und pflegte, fanden aber zu anderen nur schwer Kontakt. Aus diesen Gründen eigneten sie sich nur bedingt als Diensthunde.
In Folge dessen und um Inzuchtdepression zu vermeiden, wurden verschiedene, voneinander unabhängige Zuchtlinien aufgebaut; auch wurde eine strenge Selektion durchgeführt und nur mit ausgewählten und geeigneten DSH verpaart. Die Zucht betrieben die Grenzwacht und wenige private Züchter.
1966 wurde der erste Zuchtstandard ausgearbeitet, ein Eintrag ins Zuchtbuch wurde aber vorerst abgelehnt. Das Interesse der Züchter sank, 1971 kam es zu einem totalen Abbruch der Zucht in der tschechischen Republik. Es ist den Slowaken zu verdanken, dass diese Rasse heute überhaupt noch existiert (aus diesem Grund sollte man auch nicht vom Tschechischen Wolfshund sprechen).
Erst 1981 wurde auch in Tschechien die Zucht wieder aufgenommen. 1982 wurde der Club für Tschechoslowakische Wolfshunde gegründet, schließlich in den kynologischen Dachverband der ehemaligen CSSR aufgenommen und der TWH als nationale Rasse anerkannt. Die ersten Welpen wurden im Stammbuch in Prag eingetragen. Da seit diesem Jahr auch keine weiteren Einreuzungen des Wolfes erfolgten und die Zucht sehr hart auf gute Arbeitseigenschaften und Gesundheit selektiert wurde, ist der Tschechoslowakische Wolfshund heute nicht mehr mit Wolfshybriden zu vergleichen.
Die vorläufige Anerkennung durch die FCI erfolgte 1989, seit Juni 1999 ist der TWH endgültig von der FCI als Rasse anerkannt; als Ursprungsland gilt die ehemalige Tschechoslowakei.